Behandlung Papillomavirus in Nürnberg

Wie Papillomavirus zu behandeln? (Inhalt):

Behandlung Papillomavirus in Nürnberg

Behandlung Papillomavirus in Nürnberg

Herausgegeben vom
Berufsverband der Frauenärzte e.V. (BVF)

in Zusammenarbeit mit der
Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (DGGG)

Sicher in die Schwangerschaft

"Ich möchte von Anfang an alles richtigmachen. Meine Frauenärztin berät mich zur Folsäure-Ergänzung im Vorfeld der Schwangerschaft und komplettiert meinen Impfschutz."

Meine Zukunft ist mir wichtig

"Ich gehe regelmäßig zur Krebsfrüherkennung beim Frauenarzt. Denn je früher eine Krankheit erkannt wird, desto größer ist die Chance, sie dauerhaft zu besiegen."

Lebensqualität ist auch eine Frage der Gesundheit

"Es gab nie weniger Grund als heutzutage, in meinem Alter zuversichtlich nach vorne zu blicken, mich in vielerlei Hinsicht wohl zu fühlen und aktiv zu bleiben."

Wachstum und Entwicklung

Die Früherkennung hat in der Gynäkologie eine besonders zentrale Funktion, weil viele Erkrankungen erst in der Pubertät manifest werden.

Liebe lieber sicher

"Bei Fragen zur Verhütung und Sexualaufklärung frage ich meine Frauenärztin – ihr Fachwissen gibt mir Sicherheit und ich lerne meinen Körper zu schätzen."

Impfungen schützen

Ein umfassender Impfschutz gehört zu den wirksamsten und wichtigsten vorbeugenden Maßnahmen der Medizin – manche Impfungen müssen aufgefrischt werden.

Früh erkennen – besser heilen

Krebsfrüherkennung ist in jedem Alter wichtig. Gesetzlich Krankenversicherte haben gemäß den "Krebsfrüherkennungs- richtlinien" Anspruch auf bestimmte gesetzliche Vorsorgeleistungen.

Entwicklung & Pubertät

Verschiedene Faktoren nehmen unterschiedlich Einfluss auf Verlauf und Ausprägung der Pubertät – darunter genetische Faktoren, der Ernährungszustand des Körpers sowie die körperliche und emotionale Gesundheit.

Wechseljahre und danach

Viele Frauen sehen den Wechseljahren mit unsicheren Gefühlen entgegen. Sie sollten sich nicht entmutigen lassen, sondern diese Lebensphase als interessanten und chancenreichen Teil ihres Lebens akzeptieren.

Wissenswertes

Hilfetelefon "Gewalt gegen Frauen" steht 24 Stunden am Tag zur Verfügung

Das Hilfetelefon "Gewalt gegen Frauen" ist ein bundesweites Beratungsangebot für Frauen, die Gewalt erlebt haben oder noch erleben. Daneben gibt es noch weitere Hilfsangebote für Frauen mit Gewalterfahrung.
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Hintergrund

Pubertät: Während dieser Entwicklungs- phase finden starke Veränderungen statt

Die Reifung der Geschlechtsorgane wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Hormonen geregelt, ebenso, wie der Monatszyklus, der in der Pubertät einsetzt und erst mit der Menopause zum Stillstand kommt.

20 Jahre „Tag des alkoholgeschädigten Kindes“

Seit 20 Jahren findet jährlich am 9. September weltweit der Internationale FASD Awareness Day statt. Mit Veranstaltungen will man weltweit das Bewusstsein für die Gefahren des Alkoholkonsums während.

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Frauenärzte betreuen sämtliche Lebensabschnitte von Frauen

Frauenärzte begleiten Frauen oft über lange Phasen ihres Lebens. Sie sind nicht nur auf Erkrankungen und die Schwangerenvorsorge spezialisiert, sondern beraten auch bei Menstruations- und Wechseljahresbeschwerden, Verhütungsfragen, sexuellen Problemen sowie zur Familienplanung und vielem mehr.

Mädchen haben in der gynäkologischen Sprechstunde oder auch speziellen „Mädchensprechstunden“ die Gelegenheit, weibliches Körperwissen zu erwerben und damit die gynäkologischen Zusammenhänge positiv und wertschätzend in ihre Vorstellungen zu integrieren. Sie sind oft erst dann in der Lage, mit gewachsenen Freiheiten verantwortlich und selbstbestimmt umgehen zu können, wenn sie ihren Körper kennen und auch schätzen. Frauenärzte können Mädchen dabei helfen und auch in Bezug auf Schutz vor ungewollten Schwangerschaften, zu Schutzimpfungen sowie dem Schutz vor sexuell übertragbaren Erkrankungen informieren.

Impfschutz und Krebsfrüherkennung

Der Prävention gilt heute besonderes Augenmerk. Umfassende Untersuchungen zur Früherkennung von Krebserkrankungen gehören genauso wie verschiedene Schutzimpfungen zu den wichtigen Präventionsangeboten in frauenärztlichen Praxen.

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Humane Papillomviren (HPV) / Feigwarzen / Kondylome

Humane Papillomviren, abgekürzt HPV, sind die häufigsten sexuell übertragenen Viren der Welt. Bisher sind mehr als 200 Virustypen bekannt, von denen etwa 40 die Geschlechtsorgane befallen. Einige dieser Viren sind für die Bildung von gutartigen Feigwarzen an den Genitalien verantwortlich, andere Typen sind maßgeblich an der Entstehung von Gebärmutterhalskrebs und weiteren Karzinomen an Vulva, Vagina, Anus, im Oropharynx-Bereich, Penis und nach neueren Untersuchungen auch an der Haut beteiligt.

Die Erforschung der Aktivitäten der HP-Viren fand zunächst am Gebärmutterhals statt.
Der Gebärmutterhals (Zervix) ist die Verbindung zwischen dem unteren Bereich der Gebärmutter zur Scheide. Dort kann eine Krebserkrankung (Karzinom), das sogenannte Zervixkarzinom, auftreten.

Voraussetzung für die Entstehung eines Zervixkarzinoms ist in der Regel eine Ansteckung und langjährige Infektion mit bestimmten krebsauslösenden Humanen Papillomviren. Sie werden meist beim Geschlechtsverkehr durch direkten Haut- oder Schleimhautkontakt übertragen.

Etwa 80% aller sexuell aktiven Menschen machen mindestens einmal in ihrem Leben eine HPV-Infektion durch. Eine Infektion wird nur in sehr seltenen Fällen von Symptomen begleitet. Bei 90% der infizierten Frauen heilen diese Infektionen in einem Zeitraum von bis zu 2 Jahren ohne Therapie und ohne Folgen aus. Etwa 10% der betroffenen Frauen bleiben dauerhaft infiziert und können Zellveränderungen am Gebärmutterhals entwickeln. Nur etwa 1-3% dieser Zellveränderungen entwickeln sich über einen Zeitraum von mindestens 10 Jahren zu einem Gebärmutterhalskrebs – die übrigen heilen meist ohne Therapie aus.

Animation: Entstehung von Gebärmutterhalskrebs

Da eine Infektion in der Regel keine Beschwerden verursacht, merken die meisten Menschen nichts von der Ansteckung. Risikofaktoren, die eine Ansteckung mit den Viren begünstigen sind außer ungeschütztem Geschlechtsverkehr, Rauchen, sexuelle Kontakte in jungem Alter, wechselnde Sexualpartner und andere.

Eine bestehende Infektion mit Humanen Papillomviren kann man nicht mit Medikamenten beseitigen, nur wenn sich in Folge der Infektion Genitalwarzen gebildet haben oder Krebsvorstufen entstanden sind, gibt es Behandlungsmöglichkeiten, die sehr belastend sein können.

Es gibt eine aber eine Impfung gegen Humane Papillomviren. Dadurch können Krebsvorstufen und Krebs am Gebärmutterhals wirksam vermindert werden.

Fachliche Unterstützung: Dr. Michael Wojcinski

DE10059630A1 – Arzneimittel zur Verme >Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomaviren-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.

Die Papillomaviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirustypen bekannt, von denen einige, z. B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z. B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42, gutartige Tumore verursachen können.

Behandlung Papillomavirus in Nürnberg

Elektronenmikroskopische Analysen von BPV-1 und HPV-1 ergaben, daß die Viren aus 72 pentameren Capsomeren aufgebaut sind, die wiederum aus fünf L1-Molekülen bestehen (Baker, T. et al. (1991) Biophys. J., 60, 1445).

Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z. B. das E6-Protein und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich ist und das E1-Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte L1 und L2, die für Strukturkomponenten des Viruscapsids kodieren. Das L1-Protein ist zu über 90% im viralen Capsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1 : L2 im allgemeinen 30 : 1 ist.

HPV-6 und HPV-11 werden u. a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papillomavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In ca. 10%- 20% der Fälle wird HPV-18 mit dem Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-18 ist daher ein starker Risikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Daneben spielt das Immunsystem eine wichtige Rolle beim Fortschritt der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradigen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalem Tumor das E7-Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z. B. WO 93/20844). Die E7- induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.

Es konnte nun gezeigt werden, daß die Expression des L1-Gens bzw. die Coexpression des L1- und L2-Gens Virusähnliche Partikel (VLPs) bildet. Die VLPs konnten zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell(CTL)- Antwort notwendig zu sein scheint. Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus- ähnliche Partikel (CVLPs) entwickelt, die aus einem chimären HPV-16 L1-E7-Protein bestehen (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93): Einige CVLPs induzieren eine E7- spezifische CTL-Antwort in Mäusen, obwohl Experimente fehlschlugen, Antikörper durch Immunisieren von Mäusen mit CVLPs gegen E7 zu induzieren (Müller, M. et al. (1997), supra). Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV-assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantwort auf verabreichtes L1-Protein zu limitieren (Müller, M. et al. (1997), supra). CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7- Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs darstellen würden.

Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 beschreiben nun CVLPs bestehend aus C-terminal verkürztem L1 des Rinderpapillomvirus (BPV) und HPV-16E749-57, welche nach Impfung von C57B1/6-Mäusen E7-spezifische zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1800 beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16L1 plus HPV-16L2 fusioniert mit dem Vollängen HPV-16 E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57B1/6-Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei jedoch zytotoxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der Immunantwort weniger effizient erscheint.

Die Herstellung von VLPs bzw. CVLPs erfolgt im allgemeinen gentechnisch durch Expression der entsprechenden Gene kodierend für ein oder mehrere L-Proteine bzw. L- und E-Proteine in geeigneten Expressionssystemen. Die entsprechenden Gene sind beispielsweise bei Kirnbaum, R. et al. (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 beschrieben bzw. über die EMBL-Datenbank erhältlich. Die Zugangsnummern lauten z. B. für HPV18: PAPHPV18; für HPV31: PAPPPH31; für HPV33: PAPPPH33 oder für HPV58: PAPPPH58.

Geeignete Expressionssysteme sind beispielsweise gentechnisch veränderte Hefen, z. B. Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyvermyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) oder Hansenula (polymorpha) (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellen, wie z. B. Trichoplusia ni High Five und Spodoptera frugiperda Sf9 bzw. SF+ (siehe z. B. Müller et al. (1997), supra) oder prokaryotische Zellen (siehe z. B. WO 96/11272). Bei der Herstellung der Partikel in prokaryotischen Zellen fallen diese im allgemeinen in der Zelle aus und bilden sogenannte Einschlußkörperchen (Inclusion Bodies), die anschließend renaturiert und in Lösung gebracht werden müssen. Für die Verwendung der gentechnisch hergestellten Partikel bzw. Capside oder deren Vorstufen, den sogenannten Capsomeren, sind nach der Expression weitere Reinigungsschritte notwendig.

Ein entscheidender Nachteil der in der Literatur beschriebenen Wirkstoffe gegen HPV ist jedoch, daß sie zum einen nur eine geringe Wirkung zeigen und zum anderen bis heute keine wirksame Immuntherapie von HPV-18-spezifischem Tumor gezeigt werden konnte.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Arzneimittel bereitzustellen, mit dem wirksam humaner Papillomavirus-spezifischer Tumor vermieden bzw. behandelt werden kann, das einfach hergestellt werden kann und das für die Zulassung als Arzneimittel geeignet erscheint.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß das erfindungsgemäße Arzneimittel geeignet ist, in in vivo als auch in in vitro Testsystemen zelluläre Immunantworten gegen HPV18 Fusionsproteine auszulösen, so daß diese erfindungsgemäßen Arzneimittel auch gegen HPV-18-spezifischen Tumor wirksam sind. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe. Insbesondere enthält dieses Fusionsprotein keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope oder Papillomavirus-unspezifischen Aminosäuresequenzen.

Unter Papillomavirus-unspezifische Epitope im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man im allgemeinen Epitope im Fusionsprotein, die durch einen Fremdproteinanteil, durch post-translationale Modifikationen oder durch eine Fehlfaltung der Papillomavirus- spezifischen Proteine verursacht werden. Unter Fremdproteinanteil versteht man Aminosäuresequenzen, die nicht auf Papillomavirus-spezifische Proteine zurückzuführen sind.

Die Papillomavirus-unspezifischen Epitope können beispielsweise eine Ursache dafür sein, daß zwar neutralisierende Antikörper oder CTL-Immunantworten induziert werden, jedoch ein Papillomavirus-spezifischer Tumor nicht wirksam vermieden bzw. bekämpft werden kann, da durch unspezifische Antikörper oder CTLs die immunologische Wirkung abgeschwächt wird oder immunologische Nebenwirkungen die Wirkung des eigentlichen Wirkstoffes stören.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer Papillomaviren und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, wobei das Fusionsprotein mindestens ein Papillomavirus-unspezifisches Epitop enthält. Dieses kann beispielsweise an der jeweiligen Fusionsstelle zwischen den L-Proteinen, den E-Proteinen oder einem L- und einem E-Protein liegen. Ferner kann dieses Epitop durch eine HPV18- oder HPV-fremde Nukleinsäure codiert sein, wobei unter HPV18- oder HPV-fremde Nukleinsäure eine Nukleinsäure verstanden wird, die nicht im natürlichen Genom eines HPV18 bzw. eines HPV zu finden ist. Da derartige Epitope nicht von HPV18-infzierten Zellen eines Patienten generiert werden können, der möglicherweise mehr oder minder tolerant gegenüber der HPV18-Infektion geworden ist, kann ein derartiges zusätzliches Epitop, insbesondere in Form eines zytotoxischen T-Zell-Epitops, dazu führen, die Immuntoleranz gegenüber den HPV18 L1- und E-Proteinen zu durchbrechen. Derartige Effekte sind beispielsweise beschrieben durch Lehmann PV et al. (1993, Immuno. Today 14(5), 203-8), worin eine Immunantwort abhängig ist von einem ersten immunogenen Peptid.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel wirkt vorzugsweise zur Vermeidung oder Behandlung von gutartigem oder bösartigem Tumor, insbesondere von Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom, einschließlich deren Vorstufen, wie z. B. hochgradige CIN (cervikale intraepitheliale Neoplasie).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel kein Adjuvans, d. h. keine Substanz, die die Immunität des Papillomavirus- spezifischen Proteins verstärkt, da insbesondere die Anwesenheit eines L-Proteins vor allem von L1 die Immunität bereits ausreichend verstärkt. Diese Eigenschaft ist insbesondere bei der Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum von Vorteil, da die einzigen von den Zulassungsbehörden zugelassenen immunstimulierenden Materialien zur Zeit Aluminiumsalze sind. Zudem werden durch das Weglassen von Adjuvantien und/oder anderen Hilfs- bzw. Zusatzstoffen nicht erwünschte Nebenwirkungen vermieden.

Wie bereits oben erwähnt, ist ein weiteres wesentliches Problem bei der Verwendung von Capsiden und Capsomeren als Arzneimittel deren schlechte Löslichkeit. So neigen beispielsweise Capside oder Capsomere von HPV-18 zur Aggregation, wodurch die Löslichkeit wesentlich verringert wird. Die zum Teil geringe Löslichkeit der Capside bzw. Capsomere führt nicht nur zu einem Verlust an Ausbeute, sondern auch zu einer erschwerten Anwendung als Arzneimittel.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel daher als einen geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoff ca. 0,3 bis ca. 4 M, eines Salzes mit einem pH-Wert von ca. 7,3 bis ca. 8,5.

Der Vorteil dieser Salzlösung ist, daß das Fusionsprotein vorzugsweise als Capsid oder Capsomer in Lösung bleibt bzw. fein verteilt als Suspension vorliegt. Das Salz ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl. Die Verwendung von NaCl ist insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bevorzugt.

Der pH-Wert des Arzneimittels wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z. B. vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)- piperazino]-ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-1-propansulfonsäure). Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten Puffermolarität. Phosphatpuffer ist beispielsweise für Injektions- und Infusionslösungen geeignet.

Als weitere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, die beispielsweise zur weiteren Stabilisierung des Papillomavirus-spezifischen Proteins in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel dienen, eignen sich beispielsweise Detergentien, wie z. B. Triton-X-100 oder Natriumdesoxycholat, aber auch Polyole, wie z. B. Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B. Saccharose oder Glukose, zwitterionische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder ein Protein, wie z. B. bovines oder humanes Serumalbumin. Bevorzugt sind Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen. Andere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind Proteaseinhibitoren, wie z. B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Pepstatin A. Bevorzugt sind solche Zusatzstoffe, die keine immunologischen Nebenwirkungen induzieren.

Unter den Begriffen L-Protein, L1-Protein, L2-Protein, L1/L2-Protein und E-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Vollängen-Proteine wie auch deren Mutanten, wie z. B. Deletionsmutanten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Fusionsprotein ein deletiertes L-Protein, vorzugsweise ein deletiertes L1- und gegebenenfalls L2-Protein. Die Deletion hat den Vorteil, daß in den deletierten Bereich besonders wirksam andere Proteine, beispielsweise Papillomavirus-spezifische E- Proteinsequenzen eingefügt werden können, wodurch sich der Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erweitern läßt. Insbesondere bevorzugt ist ein L- Protein mit einer C-terminalen Deletion und insbesondere ein C-terminal deletiertes L1- Protein. Die C-terminale Deletion hat den Vorteil, daß die Effizienz der Bildung virus- ähnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleäre Lokalisationssignal deletiert ist. Die C-terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis zu ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 15 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 26 bis 28 Aminosäuren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist auch das E-Protein deletiert, vor allem das E6- und/oder E7-Protein. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der C-terminale Teil des E-Proteins deletiert ist, vorzugsweise der C-terminale Teil des E7-Proteins, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L-Protein bevorzugt Capsomere und/oder Capside ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 40 bis ca. 51 Aminosäuren. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist, wenn der N-Terminus eines E-Proteins zusätzlich oder alternativ zu einer C-terminalen Deletion, deletiert ist, vorzugsweise der N-terminale Teil des E7-Proteins, da derartige Konstrukte eine Verpackung von mehr C-terminalen Aminosäuren in Capside erlauben.

Bei der Konstruktion von HPV16 L1ΔC Fusionsproteinen hatte sich gezeigt, daß abhängig von der Länge und der spezifischen Sequenz des an HPV16 L1ΔC fusionierten Fusionspartners die Fähigkeit zur Capsidbildung verloren geht (Müller et al. 1997, supra, MediGene Patent). Gleichzeitig soll aber der an L1ΔC fusionierte E7-Anteil möglichst viele potentielle Epitope zur Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen enthalten. Eine theoretische Vorhersage zur Fähigkeit eines L1 Fusionsproteins, Capside zu bilden ist nur sehr begrenzt möglich. Deshalb wurden verschiedene HPV18 L1ΔCE7 Fusionsproteine hergestellt.

Bevorzugte Konstrukte sind HPV18 L1ΔCDIE71-53DI und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI. Bei diesen Konstrukten wird der E7-Anteil auf DNA-Ebene aus Konstruktionsgründen von zwei EcoRV Restriktionsschnittstellen flankiert. Dadurch enthält das Fusionsprotein vor und hinter dem E7 Anteil die zusätzlichen Aminosäuren Asp und Ile (DI).

Besonders bevorzugte Konstrukte sind HPV18 L1ΔC*E71-55, HPV18 L1Δ C*E71-57, HPV18 L1ΔC*E71-62, HPV18 L1ΔC*E71-64, HPV18 L1ΔC*E72-57, HPV18 L1ΔC*E72-60, HPV18 L1ΔC*E72-62 und HPV18 L1ΔC*E73-64. Diese mit einem * gekennzeichneten Konstrukte enthalten keine HPV-fremden Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte zur Herstellung eines Arzneimittels einerseits zur Verhinderung von HPV-spezifischen Tumoren und andererseits zur Regression von bereits bestehenden HPV-spezifischen Tumoren.

Zur Herstellung eines sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch wirksamen Arzneimittels ist es bevorzugt, wenn das beschriebene Papillomavirus-spezifische Fusionsprotein in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegt, da durch die Capside und/oder Capsomere und insbesondere durch den Anteil von L-Protein die Immunreaktion noch deutlich gesteigert werden kann. Als Fusionsproteine, die zur Capsid- und/oder Capsomerbildung geeignet sind, sind daher beispielsweise Fusionsproteine aus deletiertem L1 und E7, E6 und/oder E1 bevorzugt.

Capside sind im Sinne der vorliegenden Erfindung virale oder virus-ähnliche Strukturen in einer im allgemeinen ikosaedrischen Form, die im allgemeinen aus 72 Capsomeren aufgebaut sind.

Capsomere sind im Sinne der vorliegenden Erfindung assemblierte Proteine enthaltend mindestens ein Papillomavirus-Strukturprotein, vorzugsweise L1 oder Deletionen von L1. Beispielsweise können 5 erfindungsgemäße Fusionsproteine zu einem Capsomer assemblieren, die wiederum zu einem Capsid assemblieren können.

Für die Herstellung einer Kombinationsvakzine ist es vorteilhaft, Proteine bzw. Peptide aus verschiedenen HPV-Typen zu kombinieren, vorzugsweise von HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und/oder HPV-58, beispielsweise eine Kombination von HPV-16 und HPV-18 bzw. HPV-18, HPV-31, HPV- 45 und HPV-58 im Falle von z. B. Cervixcarcinom oder HPV6 und HPV-11 im Fall von z. B. Condylomen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, bei dem eine geeignete Zelle enthaltend einen geeigneten Expressionsvektor, der für das genannte Fusionsprotein kodiert, unter geeigneten Bedingungen kultiviert, das Expressionsprodukt isoliert wird und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe zugesetzt werden.

Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z. B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derviate (siehe z. B. WO 96/11272). Beispiele für eukaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) und für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren, insbesondere das Autographa Californica-Virus, wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart (siehe z. B. auch WO 94/20137), und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Es eignen sich jedoch auch kommerziell erhältliche Baculovirus Expressionssysteme wie z. B. der Baculo Gold™ Transfection Kit von Pharmingen oder das Bac-to-Bac™ Baculovirus Expressionsystems von Gibco BRL. Weitere geeignete Expressionssysteme sind rekombinante Vaccinia-Viren (siehe z. B. WO 93/02184)

Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z. B. EP-B1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z. B. EP-B1-0 127 839 oder U.S. 5,004,687) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).

Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21, die Hefestämme Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces oder Hansenula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellinien der Gattung Lepidoptera, z. B. von Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou oder Galleria Mellonela oder die tierischen Zellen COS, C127, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind (siehe z. B. WO 94/00152).

Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomavirus-spezifischen Proteine wurden beispielsweise über eine PCR ("polymerase chain reaction")-Amplifizierung aus einer Genbank isoliert und kloniert. Das Genom von HPV18 ist unter der GenBank Accession No. X05015 allgemein erhältlich und wurde von Cole und Danos publiziert (J. Mol. Biol. 1987, 193 (4), 599-608).

Die für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Fusionsproteine zugrunde gelegte Sequenz besaß dazu folgende Änderungen im L1 Gen: An den Positionen 89, 848, 1013 und 1230 des L1-Gens wurde auf DNA-Ebene ein C gegen ein G ausgetauscht. Auf Protein-Ebene führen die ersten drei Änderungen zu einem Austausch von Pro nach Arg, während die letzte Mutation keine Änderung auf Protein-Ebene zur Folge hat.

Somit lautet die zugrunde gelegte DNA-Sequenz des HPV18 L1ΔC*:

Die zugrunde gelegte Protein-Sequenz des HPV18 L1 lautet:

Dabei wird unter L1ΔC* ein L1-Protein mit den Aminosäuren 1-474 von HPV18 L1 verstanden. Unter L1ΔCDI, wird ein L1-Protein mit den Aminosäuren 1-472 und den zusätzlichen HPV-fremden Aminosäuren DI (Asp, Ile) verstanden. Die beiden in der Sequenz oben unterstrichenen Aminosäuren AG sind somit in den L1ΔCDI-Konstrukten durch DI ersetzt.

Das HPV18 E7-Gen entspricht der publizierten DNA-Sequenz und lautet für E71-64:

Die zugrunde gelegte Protein-Sequenz des HPV18 E7 lautet:

Eine andere Methode, die gewünschten Nukleinsäuren zu erhalten, ist, die Papillomavirus- spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren. Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HPV16 und HPV18 sind z. B. in WO 93/21958 offenbart. Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäuren sind beispielsweise Kirnbaum, R. et al. (1994), supra bzw. die oben bereits erwähnten in der EMBL- Datenbank hinterlegten Klone.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor so konstruiert, daß das exprimierte Fusionsprotein um keine weiteren, durch den Vektor verursachte Aminosäuren verlängert ist. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß durch Mutagenese in einer PCR-Reaktion mittels geeigneter Primer-Oligonucleotide unerwünschte Nucleotide, die für zusätzliche Aminosäuren kodieren, entfernt werden (Ho et a. (1989) Gene, 77, 51-59). Auf diese Weise erhält man ein Fusionsprotein, welches frei von zusätzlichen Aminosäuren und somit frei von möglicherweise zusätzlichen Fremdepitopen ist, die immunologische Nebenreaktionen bewirken können.

Nach der Expression des beschriebenen Fusionsproteins ist es bevorzugt, dieses weiter zu reinigen bzw. zu renaturieren. Beispiele von chromatographischen Reinigungsverfahren finden sich Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth., 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen. Virol., 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206, 126 oder WO 95/31532.

Im allgemeinen kann das Arzneimittel oral, parenteral, wie z. B. subcutan, intramuskulär oder über die Schleimhaut, in flüssiger oder suspendierter Form, in Form eines Elixiers oder als Kapseln verabreicht werden, vorzugsweise als Injektions- bzw. Infusionslösung.

Bei den erfindungsgemäßen Formulierungen kann auf ein Adjuvans verzichtet werden, was besonders vorteilhaft ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierung als Injektions- oder Infusionslösung.

Behandlung Papillomavirus in Nürnberg

Injektionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur relativ geringe Mengen einer Lösung bzw. Suspension, beispielsweise ca. 1 bis ca. 20 ml, dem Organismus zugeführt werden soll. Infusionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehre Liter, appliziert werden sollen. Da im Gegensatz zur Infusionslösung bei Injektionslösungen nur wenige Milliliter verabreicht werden, machen sich geringe Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Blutes bzw. der Gewebsflüssigkeit bei der Injektion nicht oder nur unwesentlich im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar. Eine Verdünung der erfindungsgemäßen Formulierung vor der Anwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich. Bei der Applikation größerer Mengen sollte hingegen kurz vor der Applikation die erfindungsgemäße Formulierung so weit verdünnt werden, daß eine zumindest annähernd isotonische Lösung erhalten wird. Ein Beispiel einer isotonischen Lösung ist eine 0,9%-ige Natriumchloridlösung. Bei der Infusion kann die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser während der Applikation z. B. über einen sog. Bypaß erfolgen.

Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt einen schematische Darstellung der Klonierung der HPV18 L1ΔC*E71-X Konstrukte, wobei X = 55, 57, 62 oder 64.

Fig. 2 zeigt einen schematische Darstellung der Klonierung der HPV18 L1ΔC*E7Y-Z Konstrukte, wobei Y = 2 oder 3, sowie Z = 57, 60, 62 oder 64.

Fig. 3A zeigt eine graphische Darstellung der Absorption bei 280 bzw. 260 nm aufgetragen gegen die Zeit in Minuten eines HPLC-Chromatogramms des HPV18 L1ΔC*E72-62– Fusionsproteins. Fig. 3B zeigt die Photographie einer Silberfärbung einer SDS-PAGE- Analyse der entsprechenden Fraktionen des darüber befindlichen Chromatogramms. Mit dem Pfeil ist die Hauptbande des HPV18 L1ΔC*E72-62-Fusionsproteins gekennzeichnet.

Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK- Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ- Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.

Fig. 5 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK- Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ- Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.

Fig. 6 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPV1 8 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools angegeben, "ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), L1 bzw. E7 steht für mit HPV18 L1- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv- Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.

Fig. 7 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die das Q9 Peptid präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, BLCL steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.

Beispiele 1. Herstellung von chimären Genen kodierend für HPV18 L1E7-Fusionsproteine

Zur Herstellung von HPV18 L1ΔCDI wurden zwei Primer konstruiert, die zu HPV18 L1 ORF komplementär sind. Der erste Primer hat die Sequenz
5'-ACC AGA CTC GAG ATG GCT TTG TGG CGG CCT AGT GAC-3'
und der zweite Primer
5'-ATA GCC AAG CTT AAT GAT ATC CTG AAC CAA AAA TTT ACG TCC-3'

Der erste Primer kodiert 5' eine XhoI Restriktionsenzymschnittstelle. Der zweite Primer kodiert 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle. Auf die EcoRV Stelle folgt ein TAA Translationsstopkodon, um die letzten 35 Aminosäuren des HPV18 L1 ORF zu deletieren. Das PCR-Produkt wurde mit XhoI/EcoRV gespalten und in den ebenfalls XhoI/EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript® ligiert. Das erhaltene Konstrukt HPV18 L1Δ C pKS wurde benutzt, um den ORF von HPV18 E71-53DI und HPV18 E71-60DI in die EcoRV Stelle zu klonieren.

Zur Klonierung der HPV18 E7 Fragmente wurden Primer mit einer 5'EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle verwendet. Es wurde folgende Primerpaare verwendet:
5'-GGC CAT GAT ATC ATG CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG-3' (5'-Ende des E7 Gens)
und
5'-GGC CAT GAT ATC TCG TCG GGC TGG TAA ATG TTG ATG-3' (3'-Ende des E71-53DI Fragments)
bzw.
5'-GGC CAT GAT ATC TGT GTG ACG TTG TGG TTC GGC TC-3' (3'-Ende des E71-60DI Fragments).

Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten L1-Gens insertiert.

Zur Eliminierung der EcoRV Stellen bei den HPV18 L1ΔCE71-x wurde die Tatsache genutzt, daß die ersten beiden Aminosäuren des E7 Proteins (Met-His) auf DNA-Ebene der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms NsiI (ATG CAT) entsprechen.

Zuerst wurde durch eine PCR-Reaktion ein HPV18 L1ΔCE71-2 Fragment hergestellt. Der 5'-Primer 1801 kodierte eine XhoI Schnittstelle gefolgt von einer BglII Schnittstelle, dem Startkodon sowie den ersten Nukleotiden des HPVI8 L1 Gens. Der 3'-Primer 1804 kodierte für die letzten Nukleotides des HPV18 L1ΔC Gens gefolgt von einer NsiI Schnittstelle, die die ersten sechs Nukleotides des HPV18 E7 Gens darstellt, sowie einer EcoRI Schnittstelle. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit den Enzymen XhoI/EcoRI geschnitten und in den Vektor pBluescript® (Stratagene) kloniert. Der resultierende Vektor wurde als pBSK-18L1ΔCE71-2 bezeichnet (siehe Fig. 1).

Die Fragmente für HPV18 E7 1-55, 1-57, 1-62 und 1-64 wurden ebenfalls durch PCR- Reaktionen hergestellt. Dabei wurde für alle Fragmente derselbe 5'-Primer 1805 benutzt, der für die ersten 24 Nukleotide des HPV18 E7-Gens kodierte, wobei die ersten sechs davon die NsiI-Schnittstelle darstellen. Die 3'-Primer 1806, 1807, 1808 und 1809 kodierten für die letzten 21 Nukleotide der jeweiligen HPV18 E7 Fragmente gefolgt von einem Stop-Codon und einer EcoRI-Schnittstelle. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden mit NsiI/EcoRI gespalten und in den NsiI/EcoRI aufgeschnittenen Vektor pBSK- 18L1ΔCE71-2 ligiert, so daß die Fusionsgene HPV18 L1ΔCE71-55, HPV18 L1ΔCE71-57, HPV18 L1ΔCE71-62, HPV18 L1ΔCE71-64 im Vektor pBluescript® erhalten wurden (siehe Fig. 1).

Bei der Herstellung der Fusionsgene, deren E7 Anteil erst bei Aminosäure 2 bzw. 3 beginnt, konnte die NsiI-Schnittstelle nicht benutzt werden. Zur Herstellung dieser Konstrukte wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt. Bei dem Produkt der ersten Reaktion handelte es sich um das L1ΔC* Gen, an das der Beginn des E7 Gens (beginnend ab Aminosäure 2 bzw. 3) fusioniert war. Beim Produkt der zweiten Reaktion handelt es sich um das E7 Gen (beginnend ab Aminosäure 2 bzw. 3), vor das das Ende des L1ΔC*. Gens fusioniert war. Die resultierenden DNA-Fragmente überlappten also an der Position der L1/E7 Grenze ("Four Primer PCR", Ho, S. N. et al (1989) Gene 77, 51). Jedoch enthielten die Primer keine Restriktionsenzymschnittstellen. Fragment 1 der L1ΔC*E72-x Fusionsgene wurde mit der Primerkombination 1801/1810 und Fragment 2 mit den Primerkombinationen 1812/1807 (L1ΔC*E72-57) bzw. 1812/1814 (L1ΔC*E72-60) bzw. 1812/1808 (L1ΔC*E72-62) hergestellt. Die Herstellung des L1ΔC*E73-64 Fusionsgens erfolgte nach der gleichen Methode. Bei diesem Konstrukt wurde Fragment 1 mit der Primerkombination 1801/1811 und Fragment 2 mit der Primerkombination 1813/1809 hergestellt (siehe Fig. 2).

Ein Zehntel der jeweiligen gereinigten Produkte wurde gemischt und als Matrize in der PCR-Reaktion mit ausschließlich den Primerkombinationen 1801/1807 (L1ΔC*E72-57) bzw. 1801/1814 (L1ΔC*E72-60), 1801/1808 (L1ΔC*E72-62) und 1801/1809 (L1ΔC*E3-64) benutzt. Die resultierenden Produkte wurde mit XhoI (stromaufwärts vom Startcodon) und EcoRI (stromabwärts vom Stopkodon) gespalten und in den XhoI/EcoRI aufgeschnittenen Vektor pBluescript® ligiert.

Die resultierenden HPV18 L1ΔC*E7x-y Konstrukte unterscheiden sich daher von den Klonen HPV18 L1ΔCDIE71-53DI und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI durch den Verlust der zwei internen EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen und der korrespondierenden nicht-HPV Aminosäuren Asp und Ile zwischen dem L1 ORF und E7 und stromabwärts von E7. Die erste EcoRV Stelle wurde durch die ursprünglichen L1 Aminosäuren an dieser Position ersetzt (AlaGly). Die zweite EcoRV Stelle wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt.

Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert. Anschließend wurden die HPV18 L1ΔC*E7x-y Fusionsgene durch BglII/EcoRI Restriktionsverdau aus dem Vektor pBluescript® herausgeschnitten und in den BglII/EcoRI gespaltenen Baculovirus Transfervektor pVL1392 ligiert, um rekombinante Baculoviren herzustellen.

2. Herstellung von rekombinanten Baculoviren

Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Life Technologies, Karlsruhe) mit 10% fötalem Kälberserum und herangezogen. Rekombinante Baculoviren wurden durch Cotransfektion von 5 µg der rekombinanten Plasmide und 1 µg von linearisiertem Baculo-Gold® DNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen hergestellt. Rekombinante Viren wurden durch Endpunkt­ verdünnung und/oder Plaque-Vereinzelung gereinigt. Um die Expression zu testen, wurden 10 6 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m. o. i. ("multiplicity of infection") von 0,5 und 1 für 48 h und infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM Kcl, 8,1 mM Na2PO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden dann durch FACS-Messung untersucht oder in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet.

3. Reinigung von virusähnlichen Partikeln

Für die Herstellung von CVLPs wurden Sf9 oder SF+-Zellen bei 27°C bis zu einer Dichte von 1,5-2 × 10 6 Zellen pro ml in den serumfreien Medien InsectXPress (Biowhittaker, Verviers, Belgien) oder Sf 900II (Life Technologies, Karlsruhe) gezüchtet. Eine 200 ml Kultur wurde mit einer m. o. i. von 1 bis 2 mit rekombinanten Baculoviren für 48 h infiziert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und bei -80°C eingefroren. Frier-Tau Lyse erfolgte durch Zugabe von 4 Vol. Extraktionspuffer (200 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,5). Die Klärung des Homogenats erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 rpm im Sorvall SS34 Rotor. Die Aufreinigung des L1E7 Proteins aus dem geklärten Rohextrakt für die immunologischen Assays erfolgte durch Ammoniumsulfat-Fällung bei 35-40% Sättigung und anschließende Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel® TMAE (Merck, Darmstadt), wobei die CVLPs im liearen Salzgradienten bei 300-400 mM NaCl eluiert werden. Die Bestimmung des Proteingehalts der gereinigten Fraktionen erfolgte nach der Bradford-Methode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard.

4. Capsidnachweis in gereinigten HPV18 L17-Fraktionen

Es konnte bereits zuvor für HPV16 L1ΔCE71-55 CVLPs durch Kombination mit Saccharose- Dichtegradienten-Zentrifugation und Transmissions-Elektronenmikroskopie gezeigt werden, daß für entsprechende Capside nach einer Größenaustausch-Chromatographie an einer TSKgel G6000PWXL Säule (Tosoh Haas, Stuttgart) auf einer System 1100 HPLC der Fa. Agilent eine Retentionszeit von ca. 10 + / 0,5 min (Flußrate 0,8 ml/min) spezifisch ist.

Bei der Analyse des HPV18 L1ΔC*E72-62 Fusionsproteins zeigte sich nun, daß die nach Beispiel 3 aufgereinigten Proteine nach einer Größenaustausch-Chromatographie unter identischen Bedingungen wie bei den HPV16-Capsiden mit einer Retentionszeit von 10,366 min eluierten (siehe Fig. 3A). Das Vorhandensein der HPV18 L1E7 Fusionsproteine in den Fraktionen konnte durch SDS-PAGE Analyse (siehe Fig. 3B) und Immunblot (Daten nicht gezeigt) bestätigt werden. Ein zweiter Gipfel bei 12,407 min enthält noch immer einen Teil des Konstrukts sowie eine Reihe von Verunreinigungen. Fig. 3 zeigt somit, daß das Konstrukt HPV18 L1ΔC*E72-62 unter diesen Bedingungen zu einem erheblichen Anteil in Capsiden vorliegt.

Partikelbildung konnte ebenso für folgende Konstrukte nachgewiesen werden:
L1ΔC*E71-55 L1ΔC*E71-57, L1ΔC*E71-62, L1ΔC*E73-64, L1ΔCDIE71-53DI und L1ΔCDIE71-60DI.

5. Immunogenität von HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs in Mäusen

Mehrere C3H-Mäuse wurden 2 mal mit je 20 µg eines 1 : 1 Gemisch aus HPV18 L1ΔCDIE71- 53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs bzw. zur Kontrolle mit Puffer immunisiert. Nach 2 Wochen wurden die Milzzellen nach Standardmethoden gewonnen (murine T- Zellen).

Es wurden nun um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer-Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des L1 und des E7 Proteins von HPV18 umfassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnummeriert. Ihr Name und ihre Sequenz sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPV18 L1 und E7

Unter HPV18 L1-Peptidpools wird das Gemisch der Peptide Q1 bis Q43, unter HPV18 E7- Peptidpools das Gemisch der Peptide Q44 bis Q52 verstanden.

Die murinen T-Zellen (4 × 10 5 ) von HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLP- und HPV18 L1ΔCDIE71- 60DI CVLP-geimpften C3H-Mäusen wurden für 5 Wochen mit HPV18 L1- oder E7- Peptidpools bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml je einzelnes Peptid sowie 10 5 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte Splenozyten, gewonnen nach Standardmethoden aus der Milz von nicht geimpften Mäusen) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Medium bei 37°C mit 1 µg/ml der auf der X- Achse der Fig. 3 angegebenen Peptide sowie 10 5 Antigen-präsentierende Zellen (LKK, von ATCC, Nummer CCL-1) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 (Becton Dickenson, Hamburg) restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.

Nach einer Stunde wurden 1 µl Monensin (300 µM, Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-mouse CD8/PE (monoklonaler Ratten-Antikörper gegen den extrazellulären Teil des murinen CD8 mit Fluoreszenzmarker Phycoerithrin gekoppelt, Pharmingen, Heidelberg), mit α-mouse CD4/Cychrome (monoklonaler Ratten-Antikörper, gerichtet gegen den extrazellulären Teil des murinen CD4, mit Cychrome gekoppelt, Pharmingen, Heidelberg) und mit α-mouse IFNγ/FITC (monoklonaler Ratten-Antikörper gegen das murine Interferon γ mit FITC gekoppelt, Caltag, Hamburg) gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur (fluorescens activated cell sorter, Becton Dickenson, Hamburg) untersucht und die Meßerlebnisse mit Hilfe von Cellquest Software (Becton Dickenson, Hamburg) analysiert.

Fig. 4 zeigt für die Peptide Q22, Q23, Q51, Q43 und Q44 bzw. Fig. 5 für die Peptide Q41 und Q5, daß die mit diesen Peptiden inkubierten LKK-Zellen eine Restimulation von Peptid-stimulierten murinen CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Dies bedeutet, daß die mit den HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs geimpften Mäuse zytotoxische T-Zellen ausgebildet haben, die sowohl gegen Peptide aus L1 (Q5, Q22, Q23, Q41, Q43) als auch Peptide aus E7 (Q44, Q51) gerichtet sind. Dies ist somit der Nachweis einer von zytotoxischen T-Zellen vermittelten zellulären Immunantwort nach Impfung mit den HPV18-Konstrukten in Mäusen.

6. Generierung von HPV18-spezifischen humanen T-Helferzellen

Humane T-Zellen (4 × 10 5 ) eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders wurden für 1 Woche mit HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs, 800 U/ml humanem GM-CSF (Leukomax, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) und 500 U/ml humanem IL4 (Becton Dickenson, Hamburg) sowie für weitere 5 Wochen mit HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 µg/ml des CVLPs-Gemisches (Verhältnis 1 : 1 der beiden Konstrukte) sowie 10 5 Antigen- präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC, periphere Blutmononukleäre Zellen, isoliert nach Rudolf M. P. et al (1990), Biol. Chem. 380, 335-40)) stimuliert und geerntet.

Die 20mer-Peptide Q1 bis 52 aus Beispiel 5 wurden gemäß der Matrix

Anschließend wurden die T-Zellen in 100 µl Medium bei 37°C mit den Peptidpools sowie 10 5 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL, jeweils mit Hilfe des Ebstein-Barr-Virus transformierte B-Zellinie, die für jeden Blutspender individuell hergestellt wurde, erhalten von Dr. A. Kaufmann, Jena) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 (Becton Diekenson) restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, daß für jedes einzelne Peptid 1 µg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPV18 L1- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte Zellen.

Nach einer Stunde wurde 1 µl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-human CD8/APC (monoklonaler Maus-Antikörper, gerichtet gegen den extrazellulären Teil des humanen CD8, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker APC, Caltag, Hamburg), mit α-human CD4/PerCP (monoklonaler Maus-Antikörper, gerichtet gegen den extrazellulären Teil des humanen CD4, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker PercP, Becton Dickenson, Hamburg) und mit α-human IFNγ/FITC (monoklonaler Maus- Antikörper, gerichtet gegen humanes Interferon γ, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker FITC, Caltag, Hamburg) gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.

Fig. 6 zeigt, daß insbesondere die mit den Peptidpools L1, F und 1 inkubierten BLCL eine Restimulation von humanen CD4-positiven T-Zellen bewirkten, die mit HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs stimuliert worden waren. Des weiteren zeigten die Peptidpools A und 6 eine deutlich über der Negativkontrolle liegende Restimulation. Die mit den übrigen Peptidpools inkubierten BLCL bzw. die Negativkontrolle oder die mit dem E7-Peptidpool inkubierten BLCL wiesen hingegen einen geringen Anteil an reaktiven CD4-positiven T-Zellen auf. Die Peptidpools F und 1 enthalten gemeinsam das Peptid Q6, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierten T-Zellen verantwortlich ist. Dies bedeute, daß es gelungen ist, durch Inkubation von HPV18 L1ΔCDIE71-53DI CVLPs, HPV18 L1ΔCDIE71-60DI CVLPs und humanen T-Zellen HPV18 L1-spezifische T-Helferzellen auszubilden, die – in diesem Fall – gegen das L1-Peptid Q6 gerichtet sind. Derartige HPV18-Konstrukte sind in der Lage, nach Impfung eine von T-Helferzellen vermittelte zelluläre Immunantwort gegen L1 und E7 auszulösen.

7. Generierung von HPV18-spezifischen humanen zytotoxischen T-Zellen

Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen (4 × 10 5 ) eines HLA A24-positiven Spenders für 3 Wochen mit dem HPV18 L1-Peptidpool bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe 1 µg/ml je einzelnes Peptid sowie 10 5 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet.

Anschließend wurden die Zellen in 100 µl Medium bei 37°C mit 10 µg/ml des HPV18 L1- Peptids Q9 sowie 10 5 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.

Nach einer Stunde wurden 1 µl Monensin (300 µM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α-human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.

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